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发现和抗击体内病毒的功臣 ——细说试剂盒和抗病毒药物研发中的化学反应
更新时间:2020/2/11 来源:中国化工报
  

  自新型冠状病毒引发的肺炎疫情暴发以来,关于病毒检测和治疗方面的一些科学内容迅速引发关注。除了医学相关的知识,最让人牵挂的应该就是关于病毒检测和抗病毒药物方面的知识了。前者决定了患者是否能够确诊,后者意味着我们能否更加有效地治疗疾病。在病毒检测和抗病毒药物方面,化学工业的相关技术起着举足轻重的作用,体现在药理研究、分子设计、药物合成等很多方面。


  研发思路是阻断病毒复制

  在介绍病毒检测和抗病毒药物之前,我们首先来简单的介绍我们的技术应用对象——病毒。

  如果您完整接受了中学教育,您应该会对病毒有一个基本认识。病毒是由一个核酸分子与蛋白质构成的非细胞形态,它们无法自行表现出生命现象,是介于生命体及非生命体之间的有机物种,既不是生物亦不是非生物。

  病毒由两到三个部分组成:所有病毒都含有遗传物质——核酸(RNA或DNA),多数病毒有由蛋白质形成的衣壳,用来包裹和保护其中的遗传物质。此外,部分病毒在到达细胞表面时能够形成脂质包膜环绕在外,本次的新型冠状病毒2019-nCoV就是如此。病毒的形态各异,从简单的螺旋和正二十面体到复合型结构均存在,颗粒大小大约是100纳米左右。

  我们知道,一切生物的遗传信息都储存在核酸上。对于一般的生物细胞,遗传信息的表达是一个颇为复杂却极度高效的生物化学过程。以真核细胞为例,储存在DNA上的遗传信息(表现为构成DNA的碱基对的特定排列方式)通过RNA转录,再由RNA转译,合成特定的蛋白质,从而得以进行特定的生命活动。而对于病毒来说,它必须借助侵入的特定细胞,利用这个细胞(称为宿主细胞)的现有工具进行自身遗传信息的复制和转译,从而继续传播。

  相对于一般的真核细胞,病毒的遗传信息十分简单,但复制和转译方式多样。对于病毒的检测者来说,只要能够将病毒从环境中分离出来,对其遗传物质进行检测,就可以判断是何种病毒了,这是病毒检测的思路。另外,如果我们能够阻断病毒的复制过程,我们就能阻断病毒在体内的传播,进而治疗疾病,这是抗病毒药物研发的思路。



  病毒复制机制。(资料图)

  试剂盒需要聚合酶链式反应技术

  关于本次2019-nCoV病毒检测,如果您关注新闻,您可能会了解到试剂盒这个“神器”的存在。有了试剂盒,我们就可以在极短时间内确诊病例,如果试剂盒不够用,整个新型冠状病毒肺炎的确诊都成问题。

  不过,您有没有思考过这么一个问题,试剂盒为什么能够在短时间内发现病毒,从而确诊呢?我们前面已经提到,生物遗传信息的表达方式十分复杂,速度也并不算很快。可是,传染病的防治要求医务工作者以最快的速度发现病例,并对确诊患者进行隔离和治疗,这个矛盾是如何解决的呢?

  原来,目前抗击新型冠状病毒肺炎的试剂盒,主要是利用RT-PCR技术,即Reverse Transcription-Polymerase chain reaction。翻译成中文,叫做逆转录聚合酶链式反应。聚合酶链式反应(PCR)技术是生物化学领域非常重要,且广受认可的一项应用技术,而RT-PCR技术是PCR技术在RNA病毒检测方面的衍生。

  我们首先来介绍一下PCR。在没有PCR的时代,科学家是如何复制生物基因的呢?首先,将DNA经限制酶剪裁,再利用连接酶加到运载体中,之后利用瞬间电击或是热休克的方式,送到大肠杆菌感受态细胞中,将此菌于培养皿大量繁殖培养,再经过繁复的分离、纯化过程,时间通常需要近一周,才能大量复制片段。可以想象,如果使用这种方法确诊传染病会是什么结果。

  1986年,美国生物化学家凯利·穆利斯发明了PCR,他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆利斯利用DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。在中学阶段,我们就知道,DNA聚合酶天然存在于生物体内,当DNA开始复制时,解旋酶将双股的DNA分开成两个单股,DNA聚合酶便结合在两DNA单股链上,生成互补链。在穆利斯最初的PCR中,他将双链DNA加热到96℃,使得双链分离,再加入DNA聚合酶,以在生物体外获得新的DNA链,但由于反应在高温下进行,效率不高。后来,嗜热细菌水生栖热菌体内产生的DNA聚合酶的发现,提高了PCR的效率。由于嗜热细菌生活在温度达到50℃~80℃的间歇泉中,其DNA聚合酶具有耐热性。在用于PCR时,高温并不能破坏这种DNA聚合酶,PCR由此变得简单并且可以由机器操作,大大减小了核酸检测的难度。不但如此,现在一些厂商利用蛋白质的模拟分析,将DNA聚合酶的结构进行人工修改,还可以合成出性能远超原本自然提取而来的酶。

  对于PCR来说,高效的DNA聚合酶和DNA模板是必需的,当然还有其他必需成分,如引物和缓冲剂。但对于2019-nCoV这样的RNA病毒来说,我们复制的样本并不是DNA而是RNA,这是就需要将RNA逆转录为互补DNA(cDNA),再进入DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA。目前,这个技术广泛应用于疾病的诊断,除目前的2019-nCoV,还有艾滋病病毒、埃博拉病毒、流感病毒、丙肝病毒以及麻疹病毒等,都可以用RT-PCR进行检测。

  本次2019-nCoV病毒检测,一般只需要4~6小时,即可对咽拭子样本获得比较准确的结果。目前,随着相关企业的不断研发,已有1~2小时即可出结果的检测试剂盒出现。不过,RT-PCR有一定的漏诊情况,即使多次检测,也可能会有假阴性结果出现,需要注意。



  新型冠状病毒核酸检测试剂盒。(资料图)

  药物研发依赖化学合成

  除了检测试剂,对于新型冠状病毒肺炎,人们更加关心的是如何从根本上治愈疾病。不过,截止到发稿时,还没有官方发布的特效药物出现。不过,由于医学界已经对RNA病毒的传播和感染机制有所认识,目前,研究人员正在对现有抗病毒药物进行筛选。

  抗病毒药物是药物家族中非常重要的一支。我们知道,药物与化学密不可分,目前市面上销售的绝大部分西药都是化学合成的,早期的药物化学发展史几乎等同于有机化学发展史,有机化学工业最初的产品几乎都是药物。随着化学和医学水平的不断发展,药物的结构越来越复杂,功能越来越明确。到上世纪40年代,抗生素的问世,使人类对于细菌这一病原体也有了强力药物。不过,对于另外一个重要的病原体——病毒,抗病毒药物的发展却晚了一些。

  抗病毒药物是一类用于特异性治疗病毒感染的药物,类似于抗生素治疗细菌感染一样,特定的抗病毒药物对特定的病毒起作用。但抗病毒药物和抗生素不同的是,后者消灭细菌,前者只是抑制病毒的发展。它与我们在本系列科普中提到的消毒剂不同点在于,抗病毒药物抑制体内的病毒,而后者是用于消灭体外的病毒。

  抗病毒药物的机理主要是通过影响干扰病毒复制周期的某个环节来实现抵抗病毒,包括但不限于直接抑制或杀灭病毒、干扰病毒吸附、阻止病毒穿入细胞、抑制病毒生物合成、抑制病毒释放或增强宿主抗病毒能力等。目前,市面上能看到的大多数的抗病毒药物是用于对抗艾滋病毒、疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒等。

  与发展超过70年的抗生素相比,抗病毒药物还是个“晚辈”。但过去的40年间,抗病毒药物的发展非常迅速。其中,艾滋病的不断蔓延推动了对抗病毒药物的需求,而抗艾滋病毒药物阿昔洛韦的面世,成为了抗病毒药物发展的里程碑。

  上世纪70年代,艾滋病在世界上迅猛传播。面对不断蔓延的艾滋病疫情,化学家开始从核苷类似物寻找抗病毒的良药。化学家发现,当病毒复制时,核苷类似物可以被相关酶当作核苷并用于合成其基因组,而这些类似物缺少与磷相连能够相互连接形成DNA骨架的羟基,会造成DNA的链终止,从而抑制病毒的增殖。阿昔洛韦问世。作为一种核苷类似物,它最大的特异功能就在于可以抑制病毒用于编码的胸苷激酶和DNA聚合酶,能显著地抑制感染细胞中病毒DNA的合成,而不影响非感染细胞的DNA复制。它的发明者,美国生物化学家格特鲁德·埃利恩也因此获得了1988年的诺贝尔生理学和医学奖。正是在一代代生物化学家和医学家的努力下,在得到妥善治疗的前提下,艾滋病感染者的预期生存期已得到很大程度的延长。根据估计,如果一个20岁的青年人在1996年患上艾滋病,他只能活到大约39岁。如果一个同样的20岁青年在2011年患上艾滋病,他可以活到大约70岁。

  目前,抗病毒药物共有六大类,即穿入和脱壳抑制剂、DNA多聚酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白质抑制剂、神经氨酸酶抑制剂和广谱抗病毒药。



  治疗用药正在试验

  在《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》中,在抗病毒治疗方面,写道:目前没有确认有效的抗病毒治疗方法。可试用α-干扰素雾化吸入(成人每次500万U或相当剂量,加入灭菌注射用水2ml,每日2次)、洛匹那韦/利托那韦(200mg/50mg,每粒)每次2粒,每日2次,或可加用利巴韦林静脉注射(成人每次500mg,每日2次)。要注意洛匹那韦/利托那韦相关腹泻、恶心、呕吐、肝功能损害等不良反应,同时要注意和其他药物的相互作用。而据国家卫计委透露,目前阿比多而和瑞德西韦也在进行试验。下面,我们来简要介绍一下阿比多尔、洛匹那韦/利托那韦和瑞德西韦三种药物。

  阿比多尔:阿比多尔是前苏联药物化学研究中心研制的非核苷类抗病毒药物,于1993年在俄罗斯首次上市,目前主要在俄罗斯和中国用于流感的治疗。相对于常见抗流感药物奥司他韦,阿比多尔合成简单且廉价,而其抗流感病毒的临床证据就相对不足。

  这一次在新型冠状病毒的治疗中,我们在《武汉协和医院处置2019新型冠状病毒感染策略及说明》中也看到了它的身影,但目前并没有确切的证据证明阿比多尔对于新型冠状病毒的治疗有效。武汉协和医院的那份指南后来也渐渐被新的更好的方案替代。

  洛匹那韦/利托那韦:洛匹那韦是一种新的抗HIV的蛋白酶类抑制药物,主要通过阻断Gag-Pol聚蛋白的分裂,产生未成熟的、无感染力的病毒颗粒而发挥抗HIV病毒的作用。LPV主要由肝细胞色素P450系统广泛代谢,且几乎专门由CYP3A同工酶代谢。而利托那韦不仅是一种蛋白酶抑制剂,还是一个强效的CYP3A酶抑制剂,可抑制洛匹那韦在体内的药物代谢,从而提高洛匹那韦在血浆中的药物浓度,增强抗病毒作用。所以,临床上通常是把洛匹那韦和低剂量利托那韦联合使用,这种复方制剂,商品名叫克立芝,于2000年被美国FDA批准上市。本次疫情,这个药首先被大众所了解,是因为北大第一医院呼吸和危重症医学科主任王广发居家隔离时自称用了这个药进行治疗最后痊愈,泰国的痊愈案例,很可能也是使用了克立芝。

  这个药一度给本次疫情带来希望,但是目前没有证据证明克立芝在临床中有效,目前的报道都是零星的案例,不具备代表性。细胞学和动物学研究表明,克立芝的抗冠状病毒作用和肺部保护能力不如瑞德西韦。

  瑞德西韦:瑞德西韦是一个作用于“依赖RNA的RNA合成酶(RdRp)”的广谱抗病毒药物,是由吉利德开发的一种新型实验性广谱抗病毒药物,用于治疗埃博拉病毒。据近期的一项研究显示,瑞德西韦和干扰素IFNb1-b的联合用药对MERS有显著疗效。目前,该药正在进行临床实验。

  不过,瑞德西韦的开发者吉利德公司也发表声明说:瑞德西韦尚未在任何国家获得批准上市,其安全性和有效性也未被证实。


图为在武汉市金银潭医院召开的瑞德西韦治疗2019新型冠状病毒感染研究项目启动会。 (来源:新华网)

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